Робота є комплексним дослідженням, яке спрямоване на вивчення геномних та/або негеномних ефектів вітаміну D3 у регулюванні функцій S-протеїну SARS-CoV-2. Проєкт розділено на 2 етапи: 1 етап буде виконуватись in vitro на лініях епітелійних клітин з надекпресією рецептору ACE2 (MA-104 та/або ST-cells); 2 етап буде реалізовано in vivo – на моделі аліментарного D-дефіциту у щурів.
На першому етапі планується створити генетичну конструкцію для отримання рекомбінантного S-протеїну коронавірусу SARS-CoV-2 з використанням векторів pET24a або pET28a, трансформувати лінію клітин E.coli BL21(DE3) для напрацювання протеїну та провести його очистку методом афінної хроматографії. За допомогою імуноцитохімічних методів та протокової цитофлуориметрії буде досліджено зв’язування флуоресцентно міченого S-протеїну коронавірусу SARS-CoV-2 з мембраною епітелійних клітин з надекпресією рецептору ACE2 за дії різних доз гормонально активної форми вітаміну D3 (1,25(OH)2D3). Далі з використанням імуноцитохімічних методів, конфокальної мікроскопії, вестерн-блот аналізу та ПЛР буде визначено ефективність ядерної транслокації S-протеїну SARS-CoV-2 за дії 1,25(OH)2D3 та вивчено опосередковані механізми протекторної дії вітаміну D3 із залученням NF-κB-acoційованих сигнальних шляхів на лініях епітелійних клітин MA-104 та/або ST-cells.
На другому етапі буде проведено імунізування тварин S-протеїном SARS-CoV-2, визначено дозозалежний вплив вітаміну D3 на синтез компонентів D-ауто/паракринної сиcтеми (з використанням ПЛР у реальному часі та/або вестерн-блот аналізу) та оцінено титри антитіл до S-протеїну SARS-CoV-2 (імуноензимний аналіз) в залежності від D-статусу організму. Планується отримати нові дані щодо наявності зв’язку між інтенсивністю імунної відповіді до S-протеїну SARS-CoV-2 із рівнем забезпеченості організму вітаміном D3 (за вмістом 25OHD) і станом вітамін D-ауто/паракринної системи у таргетних органах тварин (за вмістом рецептору вітаміну D – VDR, ензимів CYP27B1 та CYP24A1).