Перегляд повідомлення

Учені Інституту мікробіології і вірусології імені Д.К. Заболотного НАН України отримали й дослідили нові штами трьох відомих родів бактерій та продуковані ними речовини, перспективні для промислового і сільськогосподарського застосування.

Мікроорганізми здатні синтезувати різноманітні речовини та виділяти їх у зовнішнє середовище. Такі речовини називають метаболітами, вони широко використовуються у різних галузях промисловості та сільському господарстві. За звичайних умов росту мікроорганізми синтезують невелику кількість різних речовин – молочну кислоту, бактеріоцини (специфічні білки), пероксид водню та інше. Однак деякі сполуки (частину антибіотиків, ферменти, вітаміни, полімерні сполуки) можна отримати у промислових масштабах лише біотехнологічним шляхом. Активний розвиток науки потребує постійного пошуку продуцентів біологічних речовин із новими властивостями, здатними покращити життя людини.

З огляду на високий біосинтетичний потенціал бактерій родів Bacillus і Lactobacillus, актуальним завданням є комплексні дослідження перспективних продуцентів низки біологічно активних речовин, а також вивчення природи цих екзометаболітів та їхньої ролі у прояві біологічної активності штамів, здатних до синтезу різних речовин.

Серед бактерій роду Bacillus – велика кількість штамів, що синтезують біологічно активні екзометаболіти: ферменти, пігменти, полісахариди, поліаміни тощо. Завдяки своїм властивостям штами-продуценти можуть використовуватися при створенні на їхній основі чи на основі їхніх екзометаболітів пробіотиків і пребіотиків, препаратів для очищення питної та стічної вод, препаратів із детоксикаційною, імуностимуляційною та протипухлинною активностями, засобів біологічного контролю захворювань рослин тощо.

Схематична ілюстрація застосування метаболітів B. subtilis у сільському господарстві та медицині. Джерело: pubs.acs.org

Молочнокислі бактерії належать до групи дуже поширених у довкіллі мікроорганізмів, а також є важливою складовою нормобіоти (тобто нормальної, звичайної мікробіоти; мікробіота – це сукупність усіх мікроорганізмів, які живуть в організмі-хазяїні) людини. Вони продукують метаболіти різної природи, що мають антимікробну, антиоксидантну й антивірусну активності. Ці мікроорганізми слугують основою для ефективних і екологічно безпечних мікробіологічних препаратів широкого застосування.

Ферментовані продукти рослинного і тваринного походження, виготовлені шляхом спонтанного бродіння, посідають важливе місце у раціоні людини. Саме тому науковці зосередилися на виділенні й ідентифікації молочнокислих бактерій із характерних для України ферментованих продуктів домашнього приготування. Дослідження лактобацил із таких продуктів має як фундаментальне, так і прикладне значення, оскільки оцінка біологічної активності видового складу дає змогу відібрати штами молочнокислих бактерій, на основі яких створюються комерційні заквасочні композиції для ферментування овочевої сировини.

Попри низку робіт, присвячених дослідженню біологічної активності бацил і лактобацил, їхні екзополімери – одна з найменш вивчених груп метаболітів. Поліглутамінова кислота – природний полімер мікробного походження, перспективний для використання у різних галузях промисловості завдяки своїй високій розчинності, безпечності та біодеградабельності (тобто здатності розкладатись у природному середовищі). Тому для одержання поліглутамінової кислоти у виробничих масштабах широко використовують бактерії видів B. licheniformis і B. subtili. Фізико-хімічні властивості поліглутамінової кислоти дали змогу розробити чимало препаратів для медицини, ветеринарії, харчової промисловості, косметології тощо.

Синтез молочнокислими бактеріями екзополісахаридів надає унікальних фізичних і реологічних властивостей, завдяки яким їх використовують у харчовій промисловості як в’яжучі, стабілізувальні, гелеутворювальні агенти, особливо при виробництві кисломолочних продуктів. Крім того, показано, що екзополісахариди мають імуностимуляційну, антивірусну, протипухлинну й антиоксидантну активності.

Інший актуальний напрям сучасної біології – дослідження структурних компонентів клітини, серед яких певне місце посідають волютинові гранули. Незважаючи на давню історію відкриття волютину, чимало питань щодо його генезису, рухливості (інша англомовна назва волютинових гранул – “dancing bodies”, тобто «тільця, що танцюють»), причин варіабельності метахроматичного забарвлення а головне – функції у клітині – залишаються маловивченими. Наявність у складі волютинових гранул значного вмісту фосфору у вигляді неорганічних поліфосфатів дозволила віднести їх до запасних структур (тобто вони слугують певним резервом поживних речовин). Але сучасні дослідження участі волютину у процесах рН-гомеостазу (кислотно-лужного балансу), іонному обміні та можливих стресових реакціях дає підстави припустити, що його роль у клітині важливіша. Можливо, це обумовлено поліфункціональністю неорганічних поліфосфатів, які беруть участь у багатьох біологічних процесах: від транспорту іонів до утворення АТФ (адентозинтрифосфорної кислоти, що забезпечує енергією різні процеси у живих клітинах) і регуляції експресії генів. Поліфосфатовмісні гранули виявлено в організмів усіх ланок біологічної еволюції.

Роботи з дослідження структури, компонентного складу, особливостей функціонування волютинових гранул нечисленні та стосуються бактерій. Сучасні дослідники звертають увагу на ці поліфосфатовмісні структури через їхню роль у процесах очищення стічних вод від надлишку фосфору і катіонів токсичних металів, в явищі вірулентності патогенних бактерій, тромбоутворенні та фібринолізі, онкогенезі тощо.

Колектив учених лабораторії біологічних полімерних сполук Інституту мікробіології і вірусології імені Д.К. Заболотного НАН України у складі завідувача лабораторії кандидата біологічних наук Максима Хархоти, молодшого наукового співробітника кандидата біологічних наук Максима Харчука та наукового співробітника кандидата біологічних наук Ольги Василюк поставив собі за мету дослідити природу і фізико-хімічні властивості біологічно активних речовин бактерій родів Bacillus, Lactobacillus та Saccharomyces. Для цього науковцям знадобилося встановити природу пігментів досліджуваних штамів бактерій роду Bacillus; визначити закономірності росту й утворення каротиноїдів (природних органічних пігментів) штамами в умовах глибинного культивування; вивчити пробіотичні властивості штамів і ефективність каротинсинтезувальних штамів в експериментах in vivo (тобто на живих тканинах і цілих організмах чи всередині них); виконати скринінг (простіше кажучи, відбір) штамів бактерій роду Bacillus, здатних до синтезу екзополімерних речовин; здійснити пошук молочнокислих бактерій, що продукують біологічно активні речовини серед ізолятів із традиційних ферментованих продуктів рослинного і тваринного походження; оцінити антивірусну активність метаболітів молочнокислих бактерій; дослідити антимікробну й антиоксидантну активності бактерій роду Lactobacillus; вивчити основні промислово важливі ознаки штамів молочнокислих бактерій та оцінити перспективи їх використання у складі заквасок для виготовлення ферментованих продуктів.

Науковцям вдалося встановити, що бактерії роду Bacillus синтезують пігменти жовтого й червоного кольорів, які мають каротиноїдну природу. Основний їхній представник – апо-8´-β-каротен-3-ол. Учені дослідили закономірності синтезу штамами B. amyloliquefaciens IMB B-7513 та IMB B-7525 пігментів в умовах періодичного глибинного культивування, підібрали параметри глибинного культивування та компонентний склад живильного середовища, оптимального для синтезу штамами пігментів і накопичення їхньої біомаси. Встановлено, що синтез каротиноїдів починається у кінці експоненційної фази росту культур.

Хроматографічні показники та спектри поглинання каротиноїдів досліджуваних штамів

Уперше встановлено провітамінні та пробіотичні властивості каротинсинтезувальних штамів B. amyloliquefaciens IMB B-7513 та IMB B-7525: вони демонструють антагоністичну активність щодо умовно-патогенних мікроорганізмів, стійкість до низьких значень рН  і високих концентрацій жовчі та жовчних кислот, мають низьку адгезивну і високу ферментативну (протео-, ліпо-, ксилано-, целюлозолітичну, пектинестеразну) активності. Виявлено позитивний вплив цих штамів на нормалізацію якісного та кількісного складу мікробіоти кишківника тварин і птахів, відновлення структури їхніх тканин та органів, накопичення вітаміну А у печінці, активацію клітинної ланки імунітету.

Отже, вчені створили колекцію штамів бактерій роду Bacillus, що синтезують високі рівні каротиноїдних пігментів і поліамінних біополімерів. Отримані результати є підґрунтям для створення пробіотичного препарату із провітамінною активністю на основі штамів B. amyloliquefaciens IMB B-7513 та IMB B-7525, а також для розроблення середовища для його промислового отримання.

Під час своїх дослідів фахівці Інституту мікробіології і вірусології імені Д.К. Заболотного НАН України вивчили здатність до синтезу екзополісахаридів у близько 200 штамів молочнокислих бактерій, ізольованих із традиційних для України ферментованих овочевих і кисломолочних продуктів. Науковці встановили, що продукція екзполісахаридів не є штамоспецифічною характеристикою (тобто не є виключною характеристикою тих чи інших штамів одного виду) і показали вплив джерела виділення на синтез екзополісахариду. Встановлено, що екзополісахариди молочнокислих бактерій можуть виявляти високу протигерпетичну активність і призводити до нормалізації життєвого циклу інфікованих вірусом герпесу клітин до рівня неінфікованих клітин. Виявлено, що екзополісахариди мають множинну анти-ВПГ-1 дію (проти вірусу простого герпесу), оскільки як на ранніх, так і на пізніх етапах репродукції вірусу виявляють активність, мають віруліцидну дію (знешкоджують віруси), блокують проникнення вірусу до клітин, вихід повноцінного вірусу та знижують інфекційний титр вірусу герпесу  на 97–99%. Мікробіологи також довели позитивний вплив екзополісахаридів, продукованих молочнокислими бактеріями, на життєздатність і клітинний цикл епітеліальних клітин, чутливих до адено- та герпесвірусів.

Показано, що бактерії роду Lactobacillus, ізольовані з традиційних ферментованих продуктів, мають антиоксидатнту активність, яка зберігається і в готовому продукті, зокрема у квашеній капусті. Досліджено антимікробну активність штамів Lactobacillus щодо представників фітопатогенних мікроорганізмів і встановлено високу пригнічувальну дію штамів молочнокислих бактерій, основну роль у прояві якої відіграють, зокрема, молочна кислота, пероксид водню та антимікробні речовини білкової природи.

Завдяки отриманим даним учені створили колекцію штамів молочнокислих бактерій, здатних продукувати екзополісахариди, перспективні для практичного використання. Запропоновано екзополісахариди молочнокислих бактерій як основу для створення нових антивірусних засобів. Штам L. plantarum 47 см з антиоксидантною активністю може використовуватися для отримання ферментованих овочевих продуктів функціонального харчування, а штам L. plantarum 1047 к з пробіотичними властивостями – для заквашування овочевої сировини.

Перспективні пробіотичні штами для ферментування овочів

Мікробіологи Академії вперше встановили, що різне забезпечення дріжджових клітин фосфором призводить до зміни співвідношення морфологічних типів вакуолярного волютину. Показано, що волютинові гранули дріжджів – тверді й аморфні структури з гладкою та гідрофобною поверхнею. Вперше з’ясовано, що явище “dancing bodies” має ритмічний характер і біологічну природу, оскільки притаманне тільки живим дріжджовим клітинам, високочутливе до зовнішнього впливу фізико-хімічних чинників, залежить від фізіологічного стану клітини та пов’язане з фосфорним метаболізмом. Крім того, вчені запропонували новий метод визначення показника “dancing bodies”. Показники реакції метахромазії і рухливості волютинових гранул можна використати для біоіндикації несприятливих умов існування дріжджів.

Фахівці Інституту мікробіології і вірусології імені Д.К. Заболотного НАН України також уперше виокремили етапи формування та деградації волютинових гранул в умовах різного забезпечення дріжджових клітин фосфором і вперше розглянули явище “dancing bodies” як результат внутрішньоклітинних механо-хімічних перетворень.

Одержані результати рекомендовано до використання у навчальних курсах і посібниках.

Морфологфчні типи волютинових (поліфосфатних) гранул

У межах циклу робіт науковці виконали комплексні дослідження особливостей мікроорганізмів, що є перспективними продуцентами біологічно активних речовин. Вивчено природу певних груп екзометаболітів і їхню роль у прояві біологічної активності штамів продуцентів. Отримані результати можуть стати у пригоді при створенні біопрепаратів на основі досліджуваних штамів і/або їхніх метаболітів.

Усього колектив авторів має 53 наукові публікації, серед яких за темою вищеописаних досліджень вийшли друком 34 статті (4 з них – у зарубіжних виданнях із високим імпакт-фактором) і 12 тез доповідей. Загальна кількість посилань на публікації авторів та h-індекс роботи, згідно з базами даних, становить відповідно: у Scopus – 14/4; у Google Scholar – 59/8. Учені також отримали 7 патентів України на корисну модель.

Перелік публікацій і патентів

1. Avdeeva, L. V., Nechypurenko, O. O., & Kharhota, M. A. (2015). Probiotic features of carotene producing strains Bacillus sp. 1.1 and B. amyloliquefaciens UCM B-5113. Mikrobiolohichnyi zhurnal, 77 (2); 22-27.
2. Гармашева І.Л., Коваленко Н.К. Василюк О.М., Олещенко Л.Т. Продукція езкополісахаридів штамами молочнокислих бактерій, ізольованих з ферментованих продуктів // Мікробіологія і Біотехнологія – 2017. – Т. 40, № 4. – С. 76 – 84.
3. Kharchuk MS, Glushenkov AN, Gromozova EN. Analysis of the motion of vacuolar volutin granules in Saccharomyces cerevisiae. Folia Microbiol, 2019, 64(2): 207-213.
4. Kharchuk MS, Glushenkov AN, Gromozova EN. Analysis of the motion of vacuolar volutin granules in Saccharomyces cerevisiae. Folia Microbiol, 2019, 64(2): 207-213.
5. I Garmasheva, O. Vasyliuk, N. Kovalenko, L. Oleschenko. New approach for fast screening of lactic acid bacteria for vegetable fermentation. - J. of Microbiology, Biotechnology & Food Sciences // 2019, Vol. 8 (4), Р. 1066 –1071.
6. K. Naumenko, L Biliavska, Y Pankivska, O Povnitsa, O Vasyliuk, I Garmasheva, S Zagorodnya. Anti-herpetic activity exopolysaccharides produced by different pecies of lactic acid bacteria. - J. of Advances in Biology // 2019, Vol 12, Р. 2307 – 2315.
7. Номер патенту: 113581 (10.02.2017)

Штам Lactobacillus plantarum 47 см з антиоксидантною активністю для отримання ферментованих овочевих продуктів функціонального харчування. Гармашева І.Л., Василюк О. М., Коваленко Н. К., Підгорський В.С., Олещенко Л. Т., Лівінська О.П.

8. Номер патенту: 113580 (10.02.2017)

Штам Lactobacillus plantarum 1047к з пробіотичними властивостями для заквашування овочевої сировини. Гармашева І.Л., Василюк О. М., Коваленко Н. К., Олещенко Л. Т.

9. Номер патенту: №140653 (2019).

Спосіб ферментації капусти. Василюк О. М., Гармашева І.Л., Коваленко Н. К., Олещенко Л. Т.

Колектив науковців Інституту мікробіології і вірусології імені Д.К. Заболотного НАН України й Інституту медицини праці імені Ю.І. Кундієва НАМН України та їхню роботу («Метаболіти бактерій і дріжджів та їх функціональна активність») відзначено Премією Президента України для молодих вчених 2020 року (відповідно до Указу Президента України від 29 грудня 2020 року №595/2020). Свідоцтва та почесні знаки лауреатам Премії Президента України для молодих вчених 2020 року вручив Президент НАН України академік Анатолій Загородній – під час урочистої церемонії, що відбулася 1 березня 2021 року в Музеї науки Малої академії наук України.

Мікробіологи Академії з відзнаками. Справа наліво: Ольга Василюк, Максим Хархота, Максим Харчук. Фото – з сайту Інституту (imv.kiev.ua)

За інформацією Інституту мікробіології і вірусології імені Д.К. Заболотного НАН України